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普瑞玛“实验动物模型与药物评价”专栏(三)| 干眼症动物模型与药物评价研究进展

来源:普瑞玛    时间:2022-06-01 16:49:53    浏览:3404   

干眼症(dyreyesyndrome,xeorphhtalmia)又名角结膜干燥症,多发于 40 ~ 50 岁女性,是一种眼部和 / 或全身多种因素(如眼表功能障碍、眼部外伤、糖尿病、炎症等)引起的泪腺低分泌而导致泪膜异常、眼表上皮干变的常见眼科疾病。干眼症患者的临床初始表现包括异物感、干涩感、发痒、烧灼感、畏光、视物模糊、易视疲劳、难以名状的不适及不能耐受有烟尘的环境等 。这些症状随病情进展而加重,最终出现角膜溃疡甚至失明。本文在简单介绍干眼症发病机制及临床治疗的基础上,详细综述了干眼症的动物模型及药效评价指标,旨在为开发治疗干眼症的新药提供思路和方法。


1、干眼症的发病机制及临床治疗

干眼症的主要发病机制包括泪液动力学异常和眼表上皮异常。泪液动力学异常包括泪液的产生、排出、神经与激素调节、泪膜组成等功能失调;眼表上皮异常主要包括鳞状上皮化生及角膜缘干细胞缺乏两类。干眼症主要带来了角膜与结膜的改变。干眼症患者的角膜上皮受损、角膜表面规则性与敏感性降低、厚度变薄与结膜上皮角化等。其特征性病理改变为泪腺组织灶性淋巴细胞浸润增值,腺体组织进行性破坏,致使腺体分泌功能下降甚至丧失。维生素A 缺乏、炎症、免疫及性激素水平等因素均可以引起干眼症的产生。

干眼症现有的主要治疗方法有药物治疗与手术治疗。药物治疗主要有泪液替代药、刺激泪液分泌药物 与病因治疗药。在传统的治疗中主要采用泪液替代法进行病症治疗。然而,病情程度不同,治疗方案也有所不同。轻度患者采用人工泪液滴眼;中度患者采用人工泪液加润滑眼膏联用;重症患者除了改善临床表现外还需加用环孢霉素A 或皮质类固醇等进行病因治疗 。随着对炎症、免疫和细胞凋亡在干眼症发病机制中作用的不断深入了解,基于抗炎、抗免疫和抑制凋亡机制的治疗干眼症新药也不断涌现。干眼症的手术治疗主要有泪腺替代性手术、泪管系统阻塞术、睑裂缝合术和眼表重建术。


2、干眼症实验动物模型

干眼症实验动物模型按发病机制可以分为两大类:

泪液缺乏型和泪液蒸发过强型。按照造模手段可以分为三大类:药物造模、手术造模和内源性物质缺乏。

2.1 药物诱导型

2.1.1 胆碱能受体拮抗剂诱发干眼症模型   

副交感神经兴奋能增加泪液分泌,胆碱能受体阻断剂如阿托品和东莨菪碱等能通过抑制副交感神经兴奋,显著降低泪液分泌进而导致干眼症症状。不同胆碱能受体拮抗 剂诱导干眼症模型的病程不尽相同。在阿托品诱导的家兔干眼症模型,阿托品点眼 7 d 后,动物泪流量达最低,但点眼 14 d 后泪流量与造模前无明显差异;角膜染色检查同样显示,在 11 d 内角膜荧光素染色增加, 但 14 d 后角膜荧光素染色与造模前无明显差异,提示阿托品诱导的干眼症模型维持时间较短,不能用于长期观察。相反,皮下注射外周作用较强的氢溴酸东莨菪碱诱导的家兔干眼症模型(1% 阿托品滴眼液,4 次·d- 1,连续 14 d),随用药时间延长,泪液分泌量减少。在持续给药 28 d 后,会出现泪液黏液蛋白胶层的破坏,泪膜稳定性下降,在眼表无法形成完整泪膜, 进而发生角膜上皮点状脱失。提示该干眼症模型以泪 流量减少为主,且伴有免疫性炎症和细胞凋亡影响。

亦有文献报道,在注射氢溴酸东莨菪碱基础上复合风扇模拟干燥环境,建立泪液分泌不足合并蒸发过强型干眼模型。如在小鼠皮下注射氢溴酸东莨菪碱注射液(3 次·d - 1),然后将动物安置在双面网格笼子里,室内风扇连续吹风,保持干燥环境(湿度控制在 35% ~ 40%),每个周期为 5 ~ 10 d。该造模方法可引起泪液分泌量显著减少、结膜杯状细胞数目减少、角膜荧光染色增加等干眼体征。

2.1.2 苯扎氯铵诱发干眼症模型   

苯扎氯铵是滴眼液中常用的防腐剂,也是临床上滴眼液引起干眼症的主要因素之一。苯扎氯铵诱发干眼症的常用造模方法为BALB/c 小鼠以 0.2% 的苯扎氯铵进行点眼(每眼 5 μL/ 次,3 次·d - 1),连续 7 d。该造模方法可引起泪膜稳定性受损、眼表炎症、角膜上皮细胞凋亡与杯状细胞丢失、鳞状上皮化生等,其临床表现和相关组织病理改变均类似于人干眼症。由于苯扎氯铵诱导的干眼症症状较为严重,可用作严重型干眼造模。

2.1.3 肉毒杆菌毒素 B 诱发干眼症模型 

肉毒杆菌毒素(BTX)可通过抑制突触前膜与神经递质囊泡的融 合,阻断汗腺和泪腺的神经肌肉和胆碱能神经连接, 从而抑制泪液分泌。BTX 诱发干眼症的常见造模方法为于小鼠一侧泪腺单次注射 BTX-B。动物在第 3 日开始出现明显干眼体征,泪液分泌量下降、角膜上皮 缺损等。其优点是操作简单、损伤小、耗时短、维持时间长、干眼体征明显。

2.1.4 泪液高渗透压性干眼症模型 

泪液高渗是干眼上皮损伤的因素之一,还可直接诱发眼表的炎症反应。正常人泪液渗透压是(302±9.7)mOsm·L - 1,而干眼症患者泪液渗透压是(326.9±22.1)mOsm·L - 1。泪液渗透压大于 316 mOsm·L - 1 可作为干眼症的诊断指标。高渗透压性干眼症常用的造模方法为 BALB/c 小鼠以 500 mOsm·L - 1 氯化钠溶液点眼(5 次·d - 1), 持续 42 d。造模 7 d 后,动物角膜荧光素钠染色评分增加,角膜和结膜出现与干眼症患者类似的体征和组 织病理学变化。该模型的优点为简单可靠,重复性好。

2.2 手术造模型

2.2.1 暴露性干眼症模型 

暴露性干眼症模型是通过手术减少动物瞬目频率,使泪液蒸发过多,泪液中黏蛋白缺乏,眼表组织继而干燥失活,角膜上皮细胞坏死缺损,从而引起角膜上皮屏障功能损害而出现干眼症状。此类模型属于蒸发过强型干眼模型,主要采用大鼠和家兔进行造模,造模环境应控制温度在

(20 ~ 23)℃,相对湿度在(40±10)%。大鼠常用的造模方法是将大鼠麻醉后固定,消毒眼周皮肤,用手术线褥式缝合上下眼睑并分别固定于眶周相应皮肤上。该模型表现为泪膜破裂时间缩短、角膜荧光染色增强、泪流量明显减少等,符合干眼症的临床症状。家兔常用的造模方法是采用缝线法将兔睑缘轻度外翻,在不影响其闭合眼睑的前提下,使睑板腺开口不与眼 表接触。

2.2.2 泪液缺乏型干眼症模型 

泪液缺乏型干眼模型主要是摘除泪腺制成干眼模型,主要采用大鼠和家兔进行造模。大鼠常用的造模方法为大鼠经全身麻醉, 于耳下方约 1 cm 处沿皮纹做横行切口 1 cm,暴露皮下微黄色圆形腺体(眶外泪腺),分离周边包膜将其完整摘除,生理盐水冲洗,缝合切口;于眼外侧 1 cm 处做纵行切口 1 cm,暴露皮下白色质硬膜,切开见一三角形腺体(眶内泪腺),将其完整摘除,生理盐水冲洗,缝合切口。术后 2 周开始出现干眼症状,第 4 周症状显著。如果仅去除大鼠眶外泪腺可以导致泪液量减少 50% 和角膜荧光染色的逐渐增加。家兔常用造模方法为,切除一侧泪腺,并在切除的泪腺上皮细胞中培养自体外周血淋巴细胞 5 d 后,然后把自体外周血淋巴细胞注入兔的另一侧泪腺中,于 2 周后可诱导出类似于人类 Sjogren 综合征的自身免疫干眼症状 。

2.2.3 神经调控干眼症模型 

神经调控干眼症模型主要分为神经阻断和神经干扰两种。神经阻断模型是内耳切除岩浅大神经片段。副交感神经支配的泪腺和结膜杯状细胞是通过翼腭神经节介导实现,而岩浅大神经是副交感神经通路的一部分。因此切除岩浅大神经可导致明显的干眼症状,包括虎红染色、角膜荧光素染色均显著增加,泪液分泌量减少,泪膜破裂时间缩短,杯状细胞密度降低等。此外,将兔双眼角膜板层切开造成角膜神经反射缺失后,角膜荧光染色着色程度明显加重,14 d 后泪液分泌量显著减少,出现明显的淋巴细胞和朗格罕斯细胞浸润。该反射缺乏型干眼症模型的优点为手术操作简便,干眼症状表现稳定且持续时间长,对泪腺干扰小。神经干扰模型常用造模方法为在兔三叉神经节中插入射频探针,干扰兔眼表的神经支配。

2.3 内源物质缺乏型

2.3.1 维生素 A 缺乏干眼症模型 

维生素 A 中含有视黄酸、视黄醛、视黄醇等活性衍生物,可以维持正常 视力和免疫系统。维生素A 缺乏可导致上皮细胞过度角化、泪腺分泌减少、角膜上皮及结膜干燥而引起干 眼症 [22-23]。维生素 A 缺乏干眼症模型造模方法为以干酪素为主的维生素 A 完全缺乏饲料喂养家兔,6 个月 后,可见泪腺萎缩、结膜杯状细胞减少、角膜上皮角 化,致使泪液分泌的质与量改变,眼表上皮干燥失活,泪膜稳定性降低等干眼症症状 。

2.3.2 性激素失调干眼模型 

雄激素降低可导致结膜杯状细胞减少及睑板腺分泌功能下降,从而导致泪膜的黏蛋白成分和水样液减少,影响泪膜的稳定性,进而产生干眼症症状。主要造模方法为将雄兔双侧睾丸和附睾切除,或使用雄激素受体拮抗剂(氟他胺) 造成去势雄兔干眼症模型,可导致 Shirmer 试验减少、泪膜稳定性降低以及局部炎性反应因子(IL-1β、TNF-α)和细胞凋亡相关基因蛋白表达增强。去势干眼症模型方法简单易行,完全符合干眼症的临床表现和病理改变。

2.4 其他新型动物模型

2.4.1 炎症诱导免疫失调干眼模型 

近期研究发现,关于炎症所诱发的自身免疫疾病可引起眼表 T 细胞浸润,泪腺功能失调最终导致角膜损伤、屏障功能缺失、上皮杯状细胞减少及鳞状化生增加。炎症相关型干眼症模型常用的研究对象为 MRL/lpr 小鼠,主要造模成功特征为泪腺T 淋巴细胞浸润,其发生机制可能与 PPAR-γ 受体失活,TNF-α、IL-1β 表达增加有关。对于自身免疫缺陷伴干眼症的临床研究该动物模型具有较大的优势。

2.4.2 环境诱导型干眼模型 

干眼症的发病率和环境有着密切的关系。长期于空调房、密闭机舱、电脑房等环境的工作人群诱发干眼症的概率明显增加。为建立环境诱发干眼模型,可运用全智能化系统,对室内温度、气流量、湿度等进行严格的控制。在室内相对湿度 9.9% ~ 16.6%,气流 2.2 ~ 0.2 m·s - 1,相对温度 20 ~ 24 ℃下,C57BL/6 模型小鼠于 14 d 即可出现泪液分泌不足、结膜杯状细胞减少、荧光染色减少等干眼表现。此模型对于特殊工作环境人群干眼症患者有着较大的研究价值。


3、干眼症动物模型的药效评价指标

3.1 眼表检查

动物干眼症症状可通过眼表分析仪和裂隙灯检查角膜、结膜等形态改变等进行评判。

裂隙灯主要观察内容包括:① 泪河宽度有无变窄;② 角膜上皮的角化程度,是否出现水泡、溃疡、血管翳等异常;③ 角膜表层及下穹窿部有无碎屑;④ 结膜是否出现充血、乳头增生等;结膜囊结膜有无松弛形 成皱褶:⑤ 睑缘是否充血;或出现不规整、增厚、外翻等;腺口是否有清亮或黄色浆液阻塞、腺管模糊等。

早期或轻度的干眼症动物模型裂隙灯检查大都无明显异常,须结合染色试验进一步检查,如结膜荧光素染色和结膜虎红染色。结膜荧光素染色检测方法为滴 2 μL 的 1% 荧光素钠于眼球结膜囊内,再用 0.25% 氯霉素滴眼液进行冲洗,通过裂隙灯显微镜对染色情况进行等级评定。根据其着色程度和面积大小共分为四个等级:无染色为 0 分;散在稀疏的点状染色为 1分;较为密集的点状染色为 2 分;染色呈片状为 3 分,若点数不均以比例较大者为准,四个象限总分为 12 分。结膜虎红染色与结膜荧光素染色相似,可观察到眼表上皮的损害情况。

相比于裂隙灯,眼表分析仪可更精准的计算泪膜破裂时间及泪膜稳定性等级。此外,对于睑板腺腺体、脂质层、泪河高度等辅助指标也可进行精准的监测。眼表分析仪采用穿透摄像及自动图像成形技术,通过 智能软件分析,可自动对泪膜破裂时间及泪河高度等多指标监测结果进行评级。

3.2 泪液检查

泪液检查是干眼症评价的重要指标,包括泪液分泌试验、泪膜破裂时间和泪液蕨样变试验等。

3.2.1 泪液分泌试验(Schirmer test) 

泪液分泌试验共分为 SitⅠ和 SitⅡ两个部分。SitⅠ试验是对结膜受刺激后的基础和反射泪液总和的测量,这是最直观的估量水样液分泌试验。具体操作为在施加表麻后的 5 min 拿出滤纸,测量湿润长度,通常≥ 10 mm/5 min 为泪液分泌正常。SitⅡ试验主要是观察反射性分泌泪液的情况,其方法为用一棉棒(长为 8 mm,顶端宽为3.5 mm)沿鼻腔颞侧壁向上插入鼻腔,再放一张滤纸(方法同 Sit I 试验),5 min 后将滤纸取出,观察滤纸湿润长度,通常≥ 10  mm/5 min 为正常。

泪液分泌试验常用眼表面积较大的的兔、狗、猴 等建立动物模型,对于是否表麻以及检查时间不尽相 同。兔的 SchirmerⅠ试验正常范围为 6 ~ 10 mm 不等。对于眼表面积较小的大鼠、小鼠等动物可优先采纳酚 红棉线试验。

3.2.2 泪膜破裂时间(tear break up time,BUT) 

测定泪膜破裂时间的具体操作为用 1% 荧光素钠 2 μL 放置于下睑结膜囊,以稳定频率力手动眨眼多次后,撑开兔双眼,通过裂隙灯显微镜的散光(宽光带为 3 mm),观察瞬目后再次睁眼时泪膜观察到的第一个干斑的时间点,即为 BUT。通常 BUT > 10 s 为正常 [34-35]。

3.2.3 泪液蕨样变试验(tear ferning test,TFT) 

泪液蕨样变试验可反应泪液成分有无改变和泪液黏蛋白功能有无受损。其检测方法是用一根毛细玻璃管在下眼睑结膜囊泪阜处吸取 2 ~ 3 μL 非刺激性泪液标本(注意不要接触眼面),置于显微镜载玻片上,室温 25 ℃下干燥,光学显微镜下观察其结晶形态并进行等级划分。

结晶形态划分为Ⅰ~Ⅳ级。Ⅰ级结晶图为均匀的类羊齿状分支,其空间间隔相对狭小;Ⅱ级结晶图的形态小、分支数量不多且间隔增大;Ⅲ级结晶图分支减少明显,其间隔增大约至结晶大小;Ⅳ级无羊齿状结晶图,可见少量、不定性结晶。干眼动物模型一般泪液蕨样变试验结果为Ⅲ、Ⅳ级结晶

3.3 细胞和组织病理学检查

眼表上皮细胞的病理生理变化是干眼症动物模型评价关键指标,可通过结膜活检或结膜印迹细胞学检查,后者优点为客观、精准、半定量、无创伤。眼表 上皮细胞异常表现通常为结膜杯状细胞密度降低、结膜上皮鳞状化生增加、核浆比 N/C 比例缩小等 。杯状细胞可对整个眼表健康状态进行反映,在干眼症 评价中有着重要地位。杯状细胞在人和动物的分布均 不相同。人的杯状细胞表达于整个结膜,尤其穹隆部和半月皱裂表达丰富。大、小鼠的杯状细胞在穹隆部集中表达,兔的杯状细胞表达于整个结膜。因此建立模型时需注意造模的种属及分布部位不可随便套用诊断标准。


4、结语

随着对干眼症发病机制的进一步了解,针对新的发病机制的治疗干眼症的药物开发日益增多。如何选用合适的干眼症动物模型和药效评价指标是治疗干眼症新药非临床有效性评价的关键。

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