宫颈炎症又称宫颈糜烂，是常见妇科宫颈病变疾病之一，是慢性宫颈炎发病进程中常见的局部病理性改变。宫颈管黏膜上皮由单层柱状上皮构成，抗病毒感染能力差，易受条件致病菌影响。相关研究表明，人乳头瘤病毒（HPV）长时间持续感染，尤其是HPV16、HPV18等黏膜高危致癌性的病毒，一定程度上增加了宫颈上皮的瘤变，也提高了宫颈癌的发生率，HPV16和HPV18与世界上70%～76%的宫颈癌相关。同时，加德纳菌等条件致病菌所引起的黏液脓性宫颈炎会增加HPV的感染风险，进一步提高了宫颈癌的发生风险。椿乳凝胶的处方组成为：椿皮、苦参、牡丹皮、乳香、冰片5味药，具有清热燥湿、祛瘀生肌的功效，其功能主治为湿热淤阻型慢性宫颈炎。临床药理学研究报道：该方具有抗炎、活血化瘀、收敛消肿的功效，能促进正常鳞状上皮细胞再生，消除病因，清除局部感染及坏死组织，促进正常宫颈细胞的修复再生。因此，本文采用HPV阳性的宫颈癌细胞CaSki和Hela，就椿乳凝胶清除各类黏膜高危型HPV和调节阴道菌群平衡，治疗宫颈炎症和预防宫颈癌的机制进行如下研究。

1、材料

1.1  试药

 椿乳凝胶（规格：4 g/支，批号：20180804，株洲千金药业股份有限公司）。西多福韦CDV（批号：20171125，军事医学科学院微生物流行病研究所）。高糖DMEM培养基（批号：AB10201637，HyClone公司）；胎牛血清（Sciencell公司，批号：M048-6）；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（批号：3211713）、CCK-8（批号：B34304）（Bimake公司）；HPV16 E6抗体/ HPV18 E6抗体（批号：GR247586-18）、HPV16 E7抗体（批号：GR264171-1）、HPV18 E7抗体（批号：GR241906-1）（Abcam公司）；HEPES（Sigma公司，批号：SLBQ1006V）；朊蛋白胨（BD公司，批号：6060563）；新鲜酵母提取物（GIBCO公司，批号：1819083）；马血清（Solarbio公司，批号：912I051）；沙氏葡萄糖液体培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：20150921）。

1.2  细胞及菌株

  人宫颈上皮细胞H8、人宫颈癌细胞CaSki（HPV 16阳性）、人宫颈癌细胞Hela（HPV 18阳性）（豪地华拓生物科技有限公司）。加德纳菌（GV-10-1）和白假丝酵母菌（浙江欣力菲生物科技有限公司）

1.3 仪器 

3111型CO2培养箱（美国Thermo公司）；DMIL型倒置显微镜（德国Leica公司）；MR-96A型酶标仪（深圳迈瑞公司）；CJ-1F型医用净化工作台（苏州冯氏实验动物设备有限公司）；Accuri C6型流式细胞仪（美国BD公司）；PowerPacTM Basic型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；BSCIIB2-1101型生物安全柜（上海瑞仰净化装备有限公司）；SPX-250B型生化培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

2、方法

2.1 细胞培养

将人宫颈上皮细胞H8、人宫颈癌细胞CaSki、人宫颈癌细胞Hela复苏后接种于5 mL DMEM完全培养基中，转移至25 cm2的培养瓶中，37℃、5%CO2培养至对数生长期后备用。

2.2  菌株培养

取冻存的加德纳菌或白假丝酵母菌，水浴融化后接种至9 mL相应液体培养基试管内并混匀，同时制备一管不加菌液的培养基作为阴性对照管，硅胶塞封口后，将试管置于合适条件下培养24～48 h，分别将加德纳菌或白假丝酵母菌用相应培养液配制成浓度为1×107 CFU·mL－1的菌液，备用。

2.3  CCK-8法检测细胞存活率

取对数期生长的H8、CaSki、Hela细胞，分别以每孔5×103个细胞接种于96孔细胞培养板中，设置溶媒对照组、椿乳凝胶不同浓度组（最大溶解度10 mg·mL^－1为最大浓度，以接近√10为梯度差下设5个浓度：0.03、0.1、0.3、1、3 mg·mL^－1），同时设置西多福韦（3、10、30、100、300、1000 μg·mL^－1）作为阳性对照组，每组6个复孔。采用CCK-8法测定细胞存活情况。

2.4  流式细胞术检测人宫颈上皮细胞周期

取对数生长期的H8细胞，以5×105个/孔的密度接种至6孔板中，待细胞贴壁后，设置溶媒对照组、椿乳凝胶组（低、中、高浓度），阳性对照组，每组6个复孔。24 h后，常规消化收集细胞，用70%冷乙醇固定过夜，加5 μL的PI，室温避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

2.5  CCK-8法检测细胞存活率

取对数生长期的CaSki和Hela细胞，以5×105个/孔的密度接种至6孔板中，待细胞贴壁后，设置溶媒对照组、椿乳凝胶低、中、高浓度组，阳性对照不同浓度组，每组6个复孔。24 h后，收集细胞，加入500 μL Binding Buffer缓冲液重悬细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI，在室温避光条件下孵育15 min，用流式细胞仪检测凋亡情况。

2.6 HPV16 E6/E7蛋白、HPV18 E6/E7蛋白表达检测

细胞处理方法同步骤“2.5”项下，处理24 h后分别提取各孔总蛋白，用Western Blot法检测E6/E7蛋白表达。

2.7  最小抑菌浓度（MIC）测定

将椿乳凝胶配制为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 mg·mL^－1浓度的混悬液，将西多福韦配制成1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 μg·mL^－1浓度的溶液，各组浓度药液均放置在试管中。每管中药液为1.8 mL，各管中加入1×107 CFU·mL^－1加德纳菌或白假丝酵母菌悬液200 μL，用透气硅胶塞塞好试管，同时设置空白对照组（菌液中加入培养基作为对照）、阳性对照组（培养液中不加菌液）。将各管适宜条件下培养48 h，观察无细菌生长的浓度，即为最小抑菌浓度（MIC），在肉眼观察后，将肉眼未见浑浊浓度的培养液摇晃均匀，取100 μL上层液体，均匀涂布至相应平板上，进行加德纳菌或白假丝酵母菌的活菌计数。

2.8  统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理，计量资料以x±s表示，两样本均数的比较采用Student T-Test检验，多样本组间均数的比较采用One-way ANOVA 检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 椿乳凝胶对H8、CaSki和Hela细胞增殖的影响 

H8、CaSki和Hela细胞给予不同浓度的椿乳凝胶后，镜下观察，H8和CaSki细胞形态学未出现明显变化，细胞增殖未受到明显影响，细胞增殖抑制率均＜20%。在高浓度下，Hela细胞出现增殖速度减慢，细胞碎片增多、细胞间的间隙增大、部分细胞呈空泡状等现象。且Hela细胞状态与椿乳凝胶浓度有明确相关性，在10 mg·mL^－1浓度条件下可见较多无法维持完整细胞形态，见图1。经Bliss法计算，得出椿乳凝胶对Hela细胞的IC50＝47.558 mg·mL^－1，从表1可知椿乳凝胶对CaSki细胞的IC50在3～10 mg·mL^－1，TC0＞3 mg·mL^－1；西多福韦对CaSki和Hela细胞的IC50分别为182.100和395.196 μg·mL^－1。细胞存活率≥80%，则认为对细胞无毒性作用，记为TC0，以H8细胞TC0、1/2TC0、1/4TC0为后续实验的浓度。

因此，椿乳凝胶高、中、低终浓度设置为5、2.5、1.25 mg·mL^－1，西多福韦终浓度为100、50、25 μg·mL^－1。

图 1　各组对人宫颈上皮细胞H8（A）、人宫颈癌细胞CaSki（B）和Hela（C）的细胞毒性作用

表1　各组H8、CaSki、Hela细胞的增殖

3.2　椿乳凝胶对人宫颈上皮细胞周期的影响 

  细胞周期分析结果显示：在G0/G1细胞比例明显减少，S期细胞比例增加，G2/M期细胞比例明显增加，表明其对宫颈上皮细胞的修复作用可能是通过减少间期休眠的细胞，促进其进入G2/M期，促进细胞分裂，从而加速受损上皮细胞的更新。详见表2。

表2　各组人宫颈上皮细胞H8的周期(n＝6，x±s)

 3.3　椿乳凝胶对宫颈癌细胞凋亡的影响

椿乳凝胶5 mg·mL^－1处理时，与溶媒对照组比较，CaSki及Hela细胞凋亡率差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。西多福韦各浓度组时CaSki和Hela细胞凋亡率与溶媒对照组相比具有明显差异（P＜0.01），且具有浓度-效应关系。详见表3和图3～4。

图 3　椿乳凝胶对人宫颈癌细胞CaSki凋亡的影响

图 4　椿乳凝胶对人宫颈癌细胞Hela凋亡的影响

3.4　椿乳凝胶对HPV16 E6/E7、HPV18 E6/E7蛋白表达的影响

在给予不同剂量的椿乳凝胶后，从CaSki和Hela细胞提取的总蛋白中HPV16 E6/E7和HPV18 E6/E7蛋白表达均下调，提示椿乳凝胶清除HPV与下调E6/E7蛋白有关。结果详见图5～6。

图 5　椿乳凝胶对CaSki细胞携带的HPV16 E6/E7表达的影响

图 6　椿乳凝胶对Hela细胞携带的HPV18 E6/E7表达的影响

3.5　椿乳凝胶对加德纳菌和白假丝酵母菌最小抑菌浓度的影响 

取连续倍比稀释的椿乳凝胶药液或西多福韦与稀释菌液恒温培养，镜下观察测定椿乳凝胶或西多福韦对不同菌株的最小抑菌浓度。结果显示，椿乳凝胶有效成分中含有抑菌成分。椿乳凝胶对加德纳菌和白假丝酵母菌均有不同程度的抑菌作用，椿乳凝胶对加德纳菌和白假丝酵母菌的最小抑菌浓度分别为62.5、125 mg·mL－1。西多福韦对加德纳菌和白假丝酵母菌均无明显抑菌作用。

4、讨论

宫颈癌具有潜伏周期长的特征，是女性常见恶性肿瘤之一。研究表明，大部分感染HPV的患者会通过自身免疫系统在几个月内将HPV完全清除，但无法清除如HPV16、HPV18等高危型HPV，使HPV载量维持在高位，由此导致HPV持续感染，发展成宫颈炎及宫颈癌。HPV感染宿主细胞后，引起宫颈上皮细胞坏死并继续感染宿主细胞，导致细胞发生基因突变，改变细胞生长调控，破坏局部机体免疫系统引起宫颈癌变。

在正常阴道微环境中，益生菌群及条件致病菌群的丰度、多样性、密集性呈动态平衡状态，HPV检测也通常为阴性。当微环境中菌群稳态遭到破坏时，可增加HPV感染的风险。研究表明假丝酵母菌与HPV感染无明显相关性，真菌感染也未增加感染HPV的风险，但阴道加德纳菌与HPV感染密切相关。

椿乳凝胶各中药组分的现代药理学研究表明：椿皮、苦参、牡丹皮在体外均具有抑菌作用，同时能够提高免疫力、升高白细胞抗炎作用等。乳香可镇痛，增加多核白细胞比例，以吞噬坏死的血细胞，改善新陈代谢，具有消炎作用，可加速炎症的清除，促进伤口的愈合。

在本实验条件下，椿乳凝胶对人宫颈上皮细胞H8具有修复作用，可调节H8细胞周期，促进受损宫颈上皮细胞的更新，可促进Hela细胞进入凋亡周期，抑制携带有HPV18基因的Hela细胞增殖，对HPV18 E6/E7蛋白表达具有显著的抑制作用。体外抑菌结果表明椿乳凝胶对引起阴道菌群失调的加德纳菌和白假丝酵母菌有一定的抑制作用。

综上所述，椿乳凝胶治疗宫颈炎的机制可能是通过抑制可引起细胞癌变的HPV18 E6/E7蛋白的表达，诱导含HPV18基因的细胞凋亡，杀灭含有HPV18基因的病变细胞，清除已经产生病理性变化的阴道组织，促进正常宫颈上皮细胞的增殖，修复受损的阴道组织。同时椿乳凝胶对引起阴道菌群失调的加德纳菌和白假丝酵母菌具有较好的抑制作用，促进阴道菌群平衡的恢复。椿乳凝胶对HPV18的抑制作用和对阴道菌群的调节作用，可协同降低由HPV感染和阴道菌群失调引起的宫颈炎症向宫颈癌发展的可能性。因此椿乳凝胶在治疗HPV感染和调节阴道菌群平衡方面具有良好疗效，值得推荐用于HPV及阴道菌群失调引起的宫颈炎，同时可预防HPV感染引起的阴道炎向宫颈癌发展。