内源性化合物是机体内已存在的和代谢过程中所形成的产物或中间产物，包括维生素、激素、蛋白质及电解质等。内源性化合物广泛分布于机体内，在细胞增殖、组织修复、疾病诊断和治疗、机体自身稳态调节等方面发挥着重要作用。当前，内源性化合物发展的瓶颈效应已经由生物标志物的发现转移到评估和定量上。内源性化合物的定性和定量分析是非常复杂和困难的，干扰成分多、基质效应大、浓度范围狭窄或周期性变化等都是影响内源性化合物定量的重要因素。此外，目前尚无关于内源性化合物分析方法验证的统一指南，这也是制约内源性化合物应用的关键因素。

内源性化合物精准定量分析在非临床和临床研究中意义重大，随着液质联用技术的发展，LC-MS/MS已成为内源性化合物定量分析首选工具。内源性化合物定量分析包括相对定量、半定量和绝对定量，绝对定量可细分为标准加入法、背景扣除法、替代分析物法和替代基质法，其中替代基质法应用最为广泛。内源性化合物绝对定量因缺少真正意义上的空白基质，故在其分析过程中寻找合适的替代基质是重中之重工作。常见的替代基质包括纯溶液、人工基质和不含分析物真实基质。

1.纯溶液

纯溶液是最简单常用的替代基质之一，最常见的纯溶液为水和流动相，使用纯溶液作为替代基质需要验证分析物提取回收率和基质效应是否和真实基质具有一致性。表1总结了近年来利用纯溶液作为替代基质进行定量分析的内源性化合物。例如，人血清中血栓素B2和12（S）-羟基二十碳四烯酸替代基质选用水/甲醇/乙腈(80:10:10, v:v:v)，大鼠全血和肝脏匀浆液中丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）替代机制为水/三氯乙酸(90:10, v:v)，大鼠骨骼肌匀浆液葡糖脑苷脂(GC)定量分析替代基质为甲醇。

表1 纯溶液替代基质总结表

2.人造基质

人造基质选择原则是不含分析物且成分、盐含量、分析物溶解度、提取回收率和基质效应方面与真实基质类似。常见的人造基质包括PBS(pH7.4)、牛血清蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）等，牛血清蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）常见浓度为20~80g/L。例如，大鼠全血和皮肤匀浆液中左旋肉碱（MC）定量分析替代基质为BSA水溶液（2g/L），人血浆中不饱和脂肪酸和生长素定量分析替代基质为等渗盐水溶液。表2和表3为常见的人造基质。

表2 常见人造基质组成成分

表3 人造基质作为替代基质总结

3.不含分析物真实基质

制备不含分析物的真正基质，前提是真正的生物基质中含有的被分析物浓度非常低，或者是被分析物可通过物理或者化学手段剔除。当分析物如抗坏血酸在生物基质中易被氧化时，或者如β-胡萝卜素对空气和光照不稳定，可利用氧化手段或者增强光照消除被分析物以得到真实空白基质。生物样品中内源性酯或内酯类化合物可通过酶解方法孵化样品消除内源性酯和内酯从而制备需要的基质。

活性炭较强的吸附功能赋予其较强的内源性化合物结合能力进而除去被分析物以获得真实空白基质。利用LC-MS/MS定量分析人全血中胆红素替代基质制备选用活性炭与生物基质按照一定质量体积（1：3）循环3次获取。活性炭吸附制备空白基质需注意清除残留活性炭减少分析批间差异。此外，抗体的特异性结合能力可定向结合生物基质中被分析物，利用吸附有特异性亲和抗体试剂盒或者分离柱消除分析物可较理想获取空白基质。表4是制备真实空白基质进行定量分析的内源性物质。

图4 真实空白基质制备

参考文献

1. Rhishikesh Thakare, Yashpal S. Chhonker, Quantitative analysis of endogenous compounds. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 128 (2016) 426–437.